依托考昔對低氧缺塘誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

　　腦缺血是臨床上的常見病，死亡率很高。缺血性腦損傷引發(fā)了包括炎癥、壞死和凋亡在內(nèi)的一系列復(fù)雜的病理生理過程。

　　環(huán)氧化酶cyclooxygenase，COX是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶。研究表明，COX參與了腦缺血損傷的發(fā)生及發(fā)展，與腦缺血的預(yù)后關(guān)系密切。

　　依托考昔為選擇性COX-2抑制劑，是一種非甾體類抗感染藥，可以特異性地抑制COX-2的表達(dá)，抑制AA代謝轉(zhuǎn)化成PDE2。

　　本研究以PC12細(xì)胞低氧缺塘OGD模型模擬腦缺血損傷，探討新型COX-2抑制劑依托考昔對腦缺血損傷的影響，以期為依托考昔在臨床上治療腦缺血提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法 1.1試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，MTT，LDH試劑盒，COX-2抑制劑，羊抗鼠熒光，依托考昔尼莫地平。

　　1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞由浙江大學(xué)神經(jīng)藥理教研室饋贈(zèng)。PC12細(xì)胞培養(yǎng)與含有10%胎牛血清，青、鏈霉素各100U/ml的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37°C飽和濕度、含5%CO2和95%空氣的恒溫箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞傳至10~20代時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

　　1.2.2PC12細(xì)胞OGD模型的建立PC12細(xì)胞以1*10^4孔的密度接種于96孔板內(nèi)，貼壁24h后處理。培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞以無糖Earles平衡鹽溶液洗滌2次，換成無糖OGD液，將培養(yǎng)板置于密閉OGD灌內(nèi)，通以95%N2-5%CO2氣體，通氣30min后，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。

　　1.2.3藥物處理 PC12細(xì)胞接種于96孔板貼壁后，給以不同濃度的依托考昔預(yù)處理30min，換成OGD液進(jìn)行OGDen處理相應(yīng)時(shí)間，OGD過程中全程給藥。采用尼莫地平作為陽性對照。

　　1.2.4 MTT法檢測PC12細(xì)胞存活率 細(xì)胞經(jīng)OGD處理后，將孔內(nèi)液體換成有糖OGD液，加入MTT液使終濃度為0.5mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)液體，加入100ml二甲基亞砜溶解藍(lán)紫色復(fù)合物，振蕩10min，于酶標(biāo)儀上490nm波長處測定吸光度值。

　　1.2.5乳酸脫氫酶LDH活性檢測細(xì)胞損傷 細(xì)胞OGD及藥物處理后，收集培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明操作并計(jì)算LDH釋放率，并于對照組比較。

　　1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)+-標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)SPSS12.0軟件統(tǒng)計(jì)，兩組間各項(xiàng)檢測指標(biāo)進(jìn)行One-way ANOVA分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果 2.1OGD處理誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷鏡下觀察，正常的PC12細(xì)胞清晰可見，呈梭狀;OGD損傷后細(xì)胞皺縮、結(jié)團(tuán)，胞體折光性下降。OGD 4h細(xì)胞開始出現(xiàn)損傷，存活率為對照組的87%左右，OGD 6h細(xì)胞存活率為對照組的68%左右，與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2.2 COX-2抑制劑依托考昔對PC12細(xì)胞OGD損傷的保護(hù)作用 COX-2選擇性抑制劑依托考昔能明顯改善OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化。與對照組比較，40~80mmol/L依托考昔能顯著增加OGD 6h后PC12細(xì)胞的存活率，并降低LDH釋放率。

　　3討論缺血性腦損傷在臨床上較常見，因其較高的發(fā)病率、死亡率、致殘率及復(fù)發(fā)率影響生存質(zhì)量。缺血性腦損傷時(shí)，花生四烯酸通過代謝產(chǎn)生大量TXA2、PGs及白三烯等炎性物質(zhì)。

　　TXA2和部分前列腺素可誘導(dǎo)血小板聚積、腦血管痙攣與血管通透性增加，促進(jìn)血-腦屏障開放，加重腦損傷與腦水腫形成。同時(shí)，花生四烯酸經(jīng)COX-2mRNA與蛋白水平也有顯著增加。

　　同時(shí)研究表明，在大鼠腦缺血-再灌注模型中，COX-2選擇性抑制劑NS398、塞米昔布等均能通過縮小梗死面積減少PGE2的聚集，減少氧自由基產(chǎn)生，提高SOD活性減輕缺血后損傷，從而產(chǎn)生腦保護(hù)作用。另一種COX-2抑制劑尼美舒利能降低血-腦屏障通透性及白細(xì)胞浸潤，從而保護(hù)腦損傷。

　　本研究表明，依托考昔在離體水平上能顯著保護(hù)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。經(jīng)依托考昔處理后，PC12細(xì)胞存活率與對照組比較，在濃度為40~80mmol/時(shí)有顯著性增加，同時(shí)LDH釋放率顯著降低，顯示依托考昔對OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。

　　腦缺血是臨床上的常見病，死亡率很高。缺血性腦損傷引發(fā)了包括炎癥、壞死和凋亡在內(nèi)的一系列復(fù)雜的病理生理過程。

來源：藥品資訊網(wǎng)信息中心

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